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Biochemie - AG Trommer

Chemie / Technische Universität Kaiserslautern

Erwin-Schrödinger-Straße, 67663 Kaiserslautern
  • 0631/205-2045
  • 0631/205-3419
Profil

Kurzportrait

Projekt 1: Es ist aus vielfältigen Untersuchungen bekannt, daß Membranlipide eine Rolle bei der biologischen Funktion und gegebenenfalls enzymatischen Aktivität der in sie inkorporierten Proteine spielen. Meist handelt es sich dabei aber um Effekte unterschiedlicher Fluiditäten der Membran, wie sie z.B. auch durch Clusterbildungen bestimmter Lipide entstehen können und was z.B. das Assoziationsverhalten des Proteins beeinflussen kann. Auch die Bedeutung hydrophober Oberflächen membrandurchspannender Helices, im Wechsel ist jede dritte oder vierte Aminosäure hydrophob, ist für die Bildung von Poren und Kanälen bekannt. Weitgehend unverstanden ist aber, wie auch periphäre oder allenfalls geringfügig insertierte Proteine durch Membranlipide in ihrer Aktivität reguliert werden können. (R)-3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase ist das am besten untersuchte Beispiel eines solchen Enzyms und zugleich auch das einzige, das eine extrem hohe Spezifität für eine einzige Lipidspezies, Phosphatidylcholine (Lecithine), besitzt. Trotz der zahlreichen Untersuchungen ist der molekulare Mechanismus der Lipidabhängigkeit noch nicht bekannt. Ziel der im Rahmen dieses Projektes vorgesehenen Arbeiten ist es, die strukturellen und funktionellen Zusammenhänge der Lipidabhängigkeit der (R)-3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase besser verstehen zu lernen. Projekt 2: Im Rahmen unserer Arbeiten zur Struktur-Funktionsbeziehung in Proteinen untersuchen wir seit einiger Zeit auch die an der Proteinfaltung beteiligten Chaperone mit Hilfe der ESR-Spektroskopie unter Einsatz spinmarkierter Cofaktoren und Substrate (siehe Projekt Vogel). Insbesondere sind dies die Hitzeschockproteine DnaK (Hsp 70) und das Cochaperon GrpE sowie das GroEL/GroES-System, das wir in E. coli exprimieren. Seit kurzem untersuchen wir auch die Wechselwirkung von secB mit seinen Protein- und Peptid-Substraten. Diese Systeme sollen jetzt genutzt werden, um auch andere schwer zu faltende Proteine, die z.B. in E. coli als 'inclusion bodies' anfallen, gegebenenfalls durch Coexpression nativ zu gewinnen. Hier werden wir uns allerdings primär mit Proteinen und ihren Mutanten beschäftigen, deren Expression für unsere Arbeiten zur antigenspezifischen Immunsuppression wichtig ist (siehe Projekt 4). Hierzu zählen die a-Untereinheit des Acetylcholin-Rezeptors und seiner extrazellulären Domäne. Aber auch im Rahmen der Projekte 1 und 2 müssen ständig Mutanten exprimiert werden, deren Faltung besonders im Fall der D-3-Hydroxybutyratdehydrogenase problematisch ist. Wir erhoffen uns so langfristig allgemeine Prinzipien für den Einsatz von Chaperoninen bei der Rückfaltung gentechnisch gewonnener Proteine ermitteln zu können. Projekt 3: Transplantationen sind zur Vermeidung von Abstoáungsreaktionen ohne Einsatz des aus Pilzen isolierten Immunsuppressivum Cyclosporin A (Sandoz) heute undenkbar. Das Medikament hat aber eine gefährliche Nebenwirkung, die Bildung von Vakuolen in transplantierten Nieren und Lebern bei höherer Dosierung. Dies ist deshalb besonders problematisch, weil der Cyclosporin-Spiegel auch bei gleicher Dosierung von Patient zu Patient extrem schwankt. In Zusammenarbeit mit der Sandoz Pharma AG in Basel wird der Einfluß von Cyclosporin A (CyA) auf verschiedene physiologische Parameter unterschiedlicher Zellkulturen untersucht. Insbesondere wurden die folgenden Testsysteme aufgebaut: 1. Gewebeschnitt-Kultur der Niere, um so die Effekte von CyA und anderer Immunsuppressiva wie FK506 auf alle im Querschnitt eines Organs enthaltenen Zellarten in ihrem ursprüglichen Verbund untersuchen zu können. Nierenschnitte bis zu einer Dicke von 200-300 µm bleiben über 24 h ausreichend vital. 2. Kulturen von Leber-Couplets mit einem Couplet-Anteil von 85% und einer funktionellen Aktivität von 90 - 100%. Sie behalten bis zu 8 h ihre strukturelle Polarität bezüglich des Cytoskeletts und der Canalicula-Membran und eignen sich u.a. zur Untersuchung der Gallensäuresekretion. 3. Primäre Rattenhepatozyten im Kollagensandwich, die auch nach mehrtägiger Kultur ihre funktionelle und morphologische Integrität beibehalten. 3. Sertolizellkultur, in der die Intaktheit der Blut-Testis-Barriere in Abhängigkeit von Medikamenten wie CyA bestimmt werden kann, in Co-Kultur mit Samenzellen. Letztere werden von den Sertolizellen metabolisch essentiell unterstützt. 4. Reduzierung von Tierversuchen durch Aufbau einer höchstaufgelösten 2-dimensionalen Protein-Analyse (ISODALT Gelelektrophorese), mit deren Hilfe medikamentenabhängige Veränderungen im Proteinmuster von Leber- und Nieren-Zellen der Ratte untersucht werden. Projekt 4: Konjugate aus gewebespezifischen monoklonalen Antikörpern und Toxinen, sogenannte Immunotoxine, werden international von vielen Gruppen als mögliche Krebstherapeutika eingesetzt. Im Gegensatz dazu haben bisher nur wenige Arbeitskreise versucht, durch Gabe von Konjugaten aus Antigenen, bzw. im Fall von Autoimmunerkrankungen, von Autoantigenen mit Toxinen eine antigenspezifische Immunsuppression zu erreichen. Dieses von unserem 1986 verstorbenen Kooperationspartner G‚za Filipp entwickelte Konzept konnte von uns bei der experimentellen autoimmunen Myasthenie der Ratte erstmals erfolgreich in vivo angewendet werden. Durch zweimalige Gabe eines Konjugats aus Gelonin und Acetylcholin-Rezeptor (AChR) ergab sich eine langfristige erhebliche Verbesserung der Zahl funktionsfähiger AChRs in den neuromuskulären Endplatten myasthener Ratten. Weder das Toxin noch der Rezeptor allein zeigten einen Effekt und die Immunantwort gegen die gleichzeitig applizierten Kontrollantigene KLH und Ovalbumin war unverändert. Schwer zu verstehen war in diesem Zusammenhang aber ein mit der Therapie einhergehender Anstieg des Antikörpertiters gegen den AChR. Eine mögliche Ursache konnten Immunreaktionen gegen pathophysiologisch nicht relevante Teile des zur Induktion der Myasthenie wie zur Therapie in den Konjugaten verwendeten Rezeptors aus dem elektrischen Organ des Zitterrochens (Torpedo californica) sein. Wir haben jetzt die a-Untereinheit des Rezeptors sowie deren extrazellulären Domäne - in diesem Bereich liegt die hauptantigene determinante - in E. coli exprimiert und von beiden ein Gelonin-Konjugat synthetisiert. In unseren früheren Arbeiten wurde die Wirkung der Konjugate durch die elektrophysiologische Bestimmung der noch funktionsfähigen Rezeptoren isolierter Muskel der Versuchstiere bestimmt, die dafür zudem geopfert werden muáten. Dieses Verfahren soll daher und auch wegen des extrem hohen experimentellen Aufwandes nicht mehr angewendet werden. Prof. Dr. Toyka, PD Dr. Rieckmann, Neurologische Universitätsklinik, Würzburg werden künftig die Ableitung des Beugereflexes des Beines zur Verlaufskontrolle der Therapie myasthener Ratten benutzen. Analoge Konjugate mit dem basischen Myelin-Protein (MBP) zur Therapie der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis als Modell der Multiplen Sklerose werden ebenfalls in Würzburg sowie von Boehringer-Mannheim im Tiermodell getestet werden.

Ausstattung

Hochdruck-Chromatographieeinrichtung (HPLC) mit Dioden-Array-Detektor, 2. UV/VIS-Spektralphotometer, 3. Ultrazentrifuge