Inhaltszusammenfassung

Pflanzliche Polyphenoloxidasen (PPOs) sind eine Subklasse der ubiquitär verbreiteten Typ 3-Kupferproteine und katalysieren in Gegenwart von molekularem Sauerstoff die Umsetzung phenolischer Substrate zu korrespondierenden Chinonen, die autokatalytisch zum Pigmentfarbstoff Melanin reagieren. Katalytisch wird innerhalb der PPOs zwischen Tyrosinasen und Catecholoxidasen unterschieden. Diese sind ursächlich für die Gewebsbräunung nach Läsionen, die durch Schädlinge oder im Verarbeitungsprozess vo...Pflanzliche Polyphenoloxidasen (PPOs) sind eine Subklasse der ubiquitär verbreiteten Typ 3-Kupferproteine und katalysieren in Gegenwart von molekularem Sauerstoff die Umsetzung phenolischer Substrate zu korrespondierenden Chinonen, die autokatalytisch zum Pigmentfarbstoff Melanin reagieren. Katalytisch wird innerhalb der PPOs zwischen Tyrosinasen und Catecholoxidasen unterschieden. Diese sind ursächlich für die Gewebsbräunung nach Läsionen, die durch Schädlinge oder im Verarbeitungsprozess von Obst und Gemüse entstehen können. PPOs werden in vivo als dreiteilige, inaktive Vorstufenproteine synthetisiert und müssen somit aktiviert werden, bevor eine Katalyse erfolgen kann. In vitro gelingt die Aktivierung entweder durch Abspaltung der für die Latenz ursächlichen C-terminalen Domäne oder mittels Detergenzien wie SDS durch eine induzierte Konformationsänderung des Linkerbereiches, der die katalytische und die C-terminale Domäne verbindet. In vivo Aktivatoren sind bislang unbekannt. Ein weiteres prominentes Charakteristikum der PPOs ist eine funktionelle Aminosäure (Gate-Residue), die den Zugang für Substrate zum aktiven Zentrum beeinflusst. Ziel der Arbeit war die Identifikation eines bislang unbekannten proteolytischen Aktivators der rekombinanten latenten PPO-2 aus den Blättern der Weinrebe Vitis vinifera (L-VvPPOcs-2). Dazu wurde der Einfluss von sechs Proteasen auf die L-VvPPOcs-2 untersucht. Die entstandenen Spaltfragmente konnten mittels Massenspektrometrie den funktionellen Domänen der L-VvPPOcs-2 zugeordnet werden. Mit diesem Verfahren konnte Trypsin als proteolytischer Aktivator identifiziert werden, da es die L-VvPPOcs-2 kurz vor dem Linkerbereich hydrolysiert und einen Substratumsatz induziert. Mittels Enzymkinetiken des Wildtyps und zweier im Gate-Residue substituierter Muteine konnte erstmals der Einfluss des Gate-Residue in unterschiedlichen Zustandsformen der L-VvPPOcs-2 (als latentes 59 kDa- und als aktives 38 kDa-Fragment) untersucht werden. Die Resultate deuten darauf hin, dass das Gate-Residue nach einer induzierten Konformationsänderung durch SDS als Abstandhalter zwischen N- und C-terminaler Domäne dient, wodurch die raumfordernde Eigenschaft des Gate-Residue F259 zu einer höheren Katalyserate führte. Mit kleiner werdendem Gate-Residue wird der Zugang für Substrate zum aktiven Zentrum erschwert. Fehlt nach Proteolyse die C-terminale Domäne, liegt das Gate-Residue oberflächenexponiert vor dem Eingang zur katalytischen Tasche und nimmt so abhängig von Größe und Polarität direkten Einfluss auf die Substratspezifität und Katalyse der L-VvPPOcs-2. Es zeigte sich, dass das nach SDS-Aktivierung als Catecholoxidase geltende Mutein -F259G nach Trypsin-Aktivierung Tyrosinase-Aktivität aufweist, so dass der Aktivierungsmechnismus in der Kontroverse um die Einflussfaktoren der Suppression der Tyrosinase-Aktivität pflanzlicher PPOs künftig Berücksichtigung finden sollte.» weiterlesen» einklappen

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Klassifikation

DDC Sachgruppe:
Biowissenschaften, Biologie