Kurzfassung

Das krankheitsfreie Überleben von Leukämiepatienten nach allogener peripherer Blutstammzelltransplantation (PBSZT) wird sehr wesentlich durch die Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) und den Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekt bestimmt. Als Mediatoren der GvHD und des GvL-Effekts werden alloreaktive T-Zellen des Stammzellspenders vermutet, die HLA-assoziierte Peptidepitope aus Minor-Histokompatibilitäts- und Leukämie-assoziierten Antigenen erkennen. Die Kenntnis dieser Zielstrukturen...Das krankheitsfreie Überleben von Leukämiepatienten nach allogener peripherer Blutstammzelltransplantation (PBSZT) wird sehr wesentlich durch die Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) und den Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekt bestimmt. Als Mediatoren der GvHD und des GvL-Effekts werden alloreaktive T-Zellen des Stammzellspenders vermutet, die HLA-assoziierte Peptidepitope aus Minor-Histokompatibilitäts- und Leukämie-assoziierten Antigenen erkennen. Die Kenntnis dieser Zielstrukturen alloreaktiver T-Zellen eröffnet neue Möglichkeiten, die Spezifität und Effektivität der allogenen PBSZT zu verbessern. Im Rahmen dieses Projektes werden aus Blutlymphozyten HLA-gematchter gesunder Spender durch gemischte Lymphozyten-Leukämiezell-Kulturen (MLLC) CD8+ T-Zelllinien mit Reaktivität gegen Leukämiezellen generiert. Anschließend erfolgt eine Klonierung der Responderlymphozyten mittels des Grenzverdünnungsverfahrens (‚Limiting Dilution'-Assay). Expandierte klonale und nichtklonale T-Zellen werden in FACS-Analysen phänotypisiert und in funktionellen Assays (Zytokin-ELISPOT, 51-Chrom-Zytotoxizitätstest) auf Reaktivität gegen Leukämiezellen und ‚gesunde' Körperzellen (PHA-Lymphoblasten, Fibroblasten, Keratinozyten) getestet. Die HLA-Klasse-I-Restriktion der Responderpopulationen wird durch Antikörper-vermittelte Blockade des HLA-Restriktionselements bestimmt. Zur Identifizierung der von den CD8+ T-Zellen erkannten Peptidantigene wird eine biochemische Aufreinigung der HLA-Klasse-I-assoziierten Peptidliganden mit nachfolgender Sequenzanalyse durch Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt. Dazu werden aus einem Lysat von > 10E+10 Leukämiezellen die HLA-Klasse-I-Moleküle mittels Immunchromatographie aufgereinigt, die HLA-assoziierten Peptide durch Säureinkubation eluiert und anschließend in einer analytischen reverse phase-HPLC nach Löslichkeit aufgetrennt. HPLC-Fraktionen, die nach Beladung von antigennegativen HLA-exprimierenden Zielzellen im 51Chrom-Zytotoxizitätstest T-Zellerkennung induzieren, enthalten das bioaktive Peptidepitop. Die einzelnen Peptidspezies dieser Fraktionen werden nach erneuter Auftrennung durch mikrokapilläre LC mittels MALDI- oder ESI-Massenspektrometrie sequenziert. Hierzu bestehen Kollaborationen mit den Arbeitsgruppen von Prof. Dr. Michael Karas, Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Frankfurt, sowie mit Prof. Dr. Donald F. Hunt, in dessen Labor an der University of Virginia, Charlottesville/USA, nahezu sämtliche der humanen T-Zell-definierten Minor Histokompatibilitäts-Antigene sequenziert wurden. Kandidatenepitope werden peptidchemisch synthetisiert und auf Induktion von Bioaktivität in den leukämiereaktiven T-Zellen mittels ELISPOT oder 51-Chrom-Zytotoxizitätstest untersucht. Ist ein T-Zellepitop identifiziert, soll durch Homologiesuche in Gen/Protein-Banken das für das Peptidantigen kodierende Gen/Protein gefunden werden. Es schließen sich weitere Arbeiten zur Gewebeexpression dieses Antigens sowie zum Nachweis und zur Quantifizierung von T-Zellantworten gegen dieses Antigen im Blut von Leukämiepatienten und gesunden Testpersonen mittels ELISPOT- oder HLA-Tetramer-Analyse an. Damit soll die Relevanz eines Antigens für die Entwicklung einer GvHD sowie eines GvL-Effekts geklärt werden. Sollte das Antigen präferentiell in Leukämiezellen exprimiert sein, interessiert uns die Frage, ob es sich zum Einsatz in Studien zur therapeutischen Vakzinierung oder zum adoptiven T-Zelltransfer eignet.
Projektleitung Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Herr bis 31.03.2013» weiterlesen» einklappen