Kurzfassung

Sonic hegdehog (Shh) stellt ein Mitglied der Familie der sezernierten Hedgehog peptide dar. Initial wurden Mitglieder dieser Familie in Drosophila identifiziert und Ihnen eine Funktion bei der Etablierung einer Segmentpolarität zugeschrieben, die im weiteren zur Differenzierung von Körpersegmenten wie Kopf, Thorax, Abdomen, Flügel und Extremitäten notwendig ist. Im Rahmen einer konstitutiven Shh -/- Knock out Studie sowie einer Reihe konsekutiver Experimente konnte eine essentielle Bedeutung...Sonic hegdehog (Shh) stellt ein Mitglied der Familie der sezernierten Hedgehog peptide dar. Initial wurden Mitglieder dieser Familie in Drosophila identifiziert und Ihnen eine Funktion bei der Etablierung einer Segmentpolarität zugeschrieben, die im weiteren zur Differenzierung von Körpersegmenten wie Kopf, Thorax, Abdomen, Flügel und Extremitäten notwendig ist. Im Rahmen einer konstitutiven Shh -/- Knock out Studie sowie einer Reihe konsekutiver Experimente konnte eine essentielle Bedeutung des Shh-Signalwegs untermauert werden. Shh defiziente Tiere starben perinatal und wiesen eine Reihe von schwersten Missbildungen, insbesondere des ZNS auf.
In den letzten Jahren wurde nun zusätzlich eine eindeutige Beteiligung des Shh-Signalwegs an der Differenzierung einer Vielzahl von Tumoren belegt. Dabei wurde zunächst ein wesentlicher Einfluß von Shh auf die Differenzierung von Hirntumoren, insb. dem Medulloblatom hervorgehoben. Darüber hinaus fand sich zuletzt jedoch auch eine breite Palette weiterer Tumoren, deren Differenzierung unter dem Einfluß von Shh steht, darunter das Pankreas-Ca, Lungen-Tumoren und das Colon-Ca. All diesen Daten ist dabei gemeinsam, dass eine Überexpression bzw. Aktivierung von Shh-Signalen mit einer vermehrten Tumorinduktion einher geht. Insgesamt fällt somit dem Shh-Signalweg im Rahmen der Tumordifferenzierung eine übergeordnete Rolle zu. Ziel des Projekts war die Etablierung und Analyse eines leberspezifisch Shh deletierten Mausmodells. Dies war im Rahmen der Forschungsförderung durch MAIFOR generiert worden was durch Verpaarung einer konditionalen Shh Knock out Linie mit Albumin-Cre transgenen Mäusen gelang. Die Rekombination auf genomischer Ebene wurde mittels mutationsspezifischer PCR validiert.
Mäuse mit einer leberspezifischen Shh Deletion überleben die Embryonalentwicklung und bis ins Erwachsenenalter. Dies steht im Gegensatz zu den konstitutiven Knock out Mäusen, die perinatal sterben. Hinsichtlich der adulten Leberfunktion haben wir zunächst zur orientierenden Untersuchung serologische Marker bestimmt. Insbesondere untersuchten wir GOT, GPT und γGT. Für keinen dieser Marker ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen leberspezifisch Shh deletierten und Kontroll-Mäusen. Somit muss aufgrund der serologisch bestimmten Leberwerte von einer normalen Leberfunktion ausgegangen werden.
Im weiteren wurde die histologische Leberstruktur der erwachsenen, leberspezifisch Shh deletierten Mäuse untersucht. Dies geschah initial mittels Hämatoxilin & Eosin Färbungen. Bei Betrachtung der histologischen Proben der leberspezifisch Shh deletierten Mäuse und der Kontrollmäuse erbgaben sich auch hierbei prima vista keine signifikanten Unterschiede. Somit muss auch aufgrund des histologischen Bilds von einer normalen Leberstruktur und Leberfunktion ausgegangen werden.
Die Beduetung von Shh wurde im DEN/Phenobarbital Modell zur Induktion des Hepatozellulären Karzinoms untersucht. Hierbei ergab sich im Vergleich zu WT Tieren kein signifikanter Unterschied in Tumoranzahl oder Größe. Ein Trend entwickelte sich eher hin zu einer vermehrten Tumorbildung in den Shh deletierten Tieren.
Daraufhin haben wir die Genexpression in leberspezifisch Shh deletierten Tieren mittels cDNA-Mikroarrays untersucht um so downstream targets zu identifizieren und darüber ggf. die Bedeutung von Shh in der Leberhomöostase eingrenzen zu können.
Jeweils drei Proben von leberspezifisch Shh deletierten und Kontrollmäusen wurden gegen einen Array hybridisiert, welcher 17 000 Maus Gene enthält. Dieser wurde von Herrn Dr. Becker am National Institut of Aging/USA zur Verfügung gestellt. Die Arrays wiesen eine hohe Übereinstimmung der biologischen als auch die technischen Wiederholungen des Versuchs auf so dass von einer sehr guten Datenqualität ausgegangen werden kann. Auf Grund des enormen Umfangs der generierten Daten, der Array umfasst insgesamt ca. 17000 individuelle Gene, nimmt die Auswertung erheblich zeit in Anspruch.

In einer primären Analyse konnten insgesamt 88 hoch regulierte und 45 runter regulierte Gene identifiziert werden, die weiter untersucht und validiert werden müssen. Eine dreifach von der Norm abweichende, differentielle Regulation sowie eine mindestens 1,5 fach über dem normalisierten Mittelwert liegende Expression wurden dabei als hoch signifikant angesehen. Das Signifikanzniveau wurde dann nochmals statistisch über einen student´s t-test ermittelt. Darüber hinaus werden diese Daten derzeit mit unseren bioinformatische Resourcen auf regulierte Signalwege untersucht, um somit ebenfalls die Bedeutung von Shh in der Leber zu erfassen.































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